青海發(fā)光桿菌菌種保藏方法操作步驟

1 培養(yǎng)基制備

1.1 器皿準(zhǔn)備 培養(yǎng)基制備過(guò)程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、吸管等，經(jīng)洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。

1.2 溶解培養(yǎng)基配料 先在燒杯中放適量水，按培養(yǎng)基配方稱(chēng)取各項(xiàng)材料，依次將緩沖化合物、主要元素、微量元素、維生素等材料加入水中溶解，zui后加足水量，攪拌均勻。

1.3 調(diào)pH值 配料溶解后將培養(yǎng)基冷卻至室溫，根據(jù)要求加稀酸（0.1mol/L鹽酸）或稀堿調(diào)pH值。加酸或堿液時(shí)要緩慢、少量、多次攪拌，防止局部過(guò)堿或過(guò)酸而導(dǎo)致測(cè)量不準(zhǔn)確和營(yíng)養(yǎng)成分被破壞。

1.4 加凝固劑 配制固體培養(yǎng)基時(shí)需加凝固劑，如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養(yǎng)基中，加熱并不斷攪拌至融解，再補(bǔ)足所蒸發(fā)水分。

1.5 過(guò)濾分裝 在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁熱過(guò)濾并分裝。斜面培養(yǎng)基分裝量約為試管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培養(yǎng)基分裝量以試管高度的二分之一為宜。分裝過(guò)程中勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。

1.6 包扎標(biāo)記 將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養(yǎng)基名稱(chēng)及配制日期。

1.7 滅菌 根據(jù)要求將培養(yǎng)基滅菌，通常蒸汽滅菌為121℃，15～20min。

1.8 斜面擺放 滅菌后及時(shí)擺放斜面，斜面長(zhǎng)度不超過(guò)試管管長(zhǎng)的二分之一為宜。

1.9 無(wú)菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中作無(wú)菌檢驗(yàn)，通常30℃培養(yǎng)1～3天。無(wú)菌檢查合格后將其保存于4℃下備用。

2接種

2.1 斜面接種

2.1.1 點(diǎn)接

把菌種點(diǎn)接在斜面中部偏下方處。適用于擴(kuò)散型生長(zhǎng)及絨毛狀氣生菌絲類(lèi)霉菌（如毛霉、根霉等）。

2.1.2 中央劃線

從斜面中央自下而上劃一直線。適用于細(xì)菌和酵母菌等。

2.1.3 稀波狀蜿蜒劃線法

從斜面底部自下而上劃“之”字形線。適用于易擴(kuò)散的細(xì)菌，也適用于部分真菌。

2.1.4 密波狀蜿蜒劃線法

從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細(xì)胞，適用于細(xì)菌和酵母菌等。

2.1.5 挖塊接種法

挖取菌絲體連同少量培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔(dān)子菌類(lèi)真菌。

2.2 穿刺接種

用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細(xì)菌和酵母菌等。

2.3 液體接種

挑取少量固體斜面菌種或用無(wú)菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基中。

3 培養(yǎng)

將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，在適宜的條件下培養(yǎng)至細(xì)胞穩(wěn)定期或得到成熟孢子。細(xì)菌培養(yǎng)溫度一般為30～37℃，真菌培養(yǎng)溫度一般為25～28℃。 4 保藏 培養(yǎng)好的菌種于4～6℃保存，根據(jù)要求每3～6個(gè)月移植一次。

某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，須1～3個(gè)月移植一次。 保藏濕度用相對(duì)濕度表示，通常為50%～70%。 斜面菌種應(yīng)保藏相繼三代培養(yǎng)物以便對(duì)照，防止因意外和污染造成損失。