質(zhì)粒是使用廣泛的基因操作工具，可以進(jìn)行編碼基因、microRNA、lncRNA的功能研究、啟動(dòng)子活性、轉(zhuǎn)錄因子及3’UTR調(diào)控研究等。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1)質(zhì)粒提取
1.10,0001min離心收集1.5-5ml菌液沉淀于1.5ml離心管中
2.加入100溶液1，振蕩至懸浮
3.加入200溶液2，立即輕柔顛側(cè)離心管6次，使菌體充分裂解，隨后將離心管冰上放置3分鐘
4.加入150山溶液3，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，冰上放置3分鐘，10,00g離心10mins
5.將步驟4的上清轉(zhuǎn)移至新的離心管(盡量去除雜質(zhì))，加入等體積的苯酚/氖仿/異成醇混
合均勻10,000離心5min
6.將步驟5的上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，室溫放置5-1omin，沉
降DNA
7.10000g離心10分鐘，棄乙醇，保留沉淀，加入1ml706的乙醇洗滌沉淀，10,000離心5分鐘
8.倒掉乙醇溶液，用吸水紙吸凈管壁上的水珠，室溫蒸發(fā)痕量乙醇
9.加入適量含Rnase的TE或滅菌雙蒸水溶解質(zhì)粒DNA
2）質(zhì)粒鑒定瓊脂糖礙膠電泳
灌膠：膠中加入芡光染料< SYBR Green)
加樣：質(zhì)粒+上樣緩沖液→混勻
電泳
結(jié)果觀(guān)察：UV燈下
實(shí)驗(yàn)分析：
裂解細(xì)胞中除含有質(zhì)粒DNA外，還含有基因組DNA、各種RNA、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)等物質(zhì)，因
用堿裂解法除去雜質(zhì)
1、防止DNA裂解: Solution1
1)、所含糖增加溶洨黏度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切作用降解
2)、所含EDTA抑制酶活性
2、溶解與變性：Solution2
滬ICP備14030958號(hào)-14 管理登陸 技術(shù)支持：化工儀器網(wǎng) GoogleSitemap