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    切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)

    點(diǎn)擊次數(shù):2131  更新時間:2015-08-10

    抗體稀釋液

        其實許多實驗室抗體稀釋液就用一般PBS即可,但的抗體稀釋液中除PBS成份外,還加了*防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份,對抗體的多次回收利用較好。正因為這種原因,我一直用國產(chǎn)的抗體稀釋液,一段時間在更換新抗體稀釋液時實驗結(jié)果出現(xiàn)了陰性結(jié)果(提示可能一抗沒有結(jié)合),zui后從抗體濃度和孵育時間、封閉時間等原因排除后,發(fā)現(xiàn)是新抗體稀釋液的PH值偏酸,而使抗原抗體反應(yīng)不佳,終而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

    切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)

        為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗(延長時間和增多次數(shù))尤為重要,我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次,而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。
    注意:

    ①單獨(dú)沖洗,防止交叉反應(yīng)造成污染。

    ②溫柔沖洗,防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式;

    ③沖洗的時間要足夠,才能*洗去結(jié)合的物質(zhì)。

    ④PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn),當(dāng)時我買的抗體稀釋液偏酸,結(jié)果背景一片黃(未見特異性染色),建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。(中性及弱堿性條件(PH7-8)有利于免疫復(fù)合物的形成,而酸性條件則有利于分解;低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成,而高離子強(qiáng)度則有利于分解)

    DAB顯色

        背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的,主要由顯微鏡下控制顯色時間,到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時即可沖洗;DAB顯色時間很短(如幾秒或幾十秒)就出現(xiàn)很深的棕褐色,這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長,需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間;此外,若很短時間就出現(xiàn)背景很深,還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全,需要延長封閉時間;DAB顯色時間很長(如超過十幾分鐘)才出現(xiàn)陽性染色,一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短(一抗4℃);另一方面就是封閉時間過長。

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